生物素标准物质的研制

 生物素是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，是一种维持人体自然生长和正常人体机能所必需的水溶性维生素，也是维持正常成长、发育及健康必要的营养素，无法由人工合成。当人体缺乏时会产生精神疲乏、恶心、呕吐、贫血、鳞状皮炎等症状。目前，生物素常作为添加剂添加在食品、饮料以及家禽家畜的饲料中。国家标准对婴儿食品生物素添加剂也有相关要求。
    已报道的生物素检测方法中，常用的方法有酶联免疫法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和质谱法等，这些方法大多是相对测量的方法，需要用生物素标准物质作为测量标准才能准确定量。目前未见国内外有关生物素标准物质的报道。
    研制具有准确纯度及不确定度水平的生物素纯度标准物质，对食品检验具有重要意义，也是国家量值溯源能力的重要保证。笔者根据国际标准化组织ISO导则35及JJF1343-2012 《标准物质定值的通用原则》及统计学原理研制了生物素标准物质。
    

一、实验部分

    1.主要仪器与试剂
    Agilent 1100型高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器(DAD)；Perkin Elmer公司Pyris 1型热重分析仪(TGA)；Perkin Elmer 公司Pyris 1 型差示扫描量热仪(DSC)；布鲁克公司Bruker AVANCE DRX-600(NMR)；Agilent 7500c型电感耦合离子体质谱仪(ICP-MS)。Inertsil ODS-3，250mm×4.6×5μm液相色谱柱(GL Science Inc.日本)。生物素(购自美国Sigma_Adrich)。乙醇为色谱级，德国Merck公司，其余试剂为分析纯。实验用水皆为二次去离子水。
    2.原料获得及标准物质
    生物素标准物质候选物，经理化测试、定性分析、初步测定确定其纯度在99%以上，均匀性初检合格后，分装到事先清洗、干燥的棕色小玻璃瓶中，每瓶20mg，共200瓶，4℃下储存。
    3.定性分析
    采用红外光谱法对生物素标准物质主成分进行定性分析，所用仪器为Thermo公司Thermo Scientific NICOLET iS10型傅立叶变换红外光谱仪。
    4.定值分析
    采用质量平衡法与差示扫描量热法(DSC)两种不同原理的方法对生物素标准物质进行定值分析。
    (1)质量平衡法
    质量平衡法即扣除杂质法，计算公式如下:
    P=Po(1-Xv-Xw-Xa-Xe)
    式中:Po——液相色谱法纯度；Xv——挥发性物质的含量；Xw——水分含量；Xa——灰分的含量；Xe——无机元素的含量。
    ①液相色谱法(HPLC)纯度
    采用液相色谱归一化法测定的纯度Po，研究中高效液相色谱法根据文献进行条件优化，即考虑检测波长、流动相比例和流动相pH值等因素，加以优化使杂质与主成分完全分离，保证最小检测峰面积0.005%以上的组分均能检出，满足定值要求。确定的高效液相色谱法条件如下:流动相为乙醇与0.05mmol·mL-1KH2PO4 缓冲溶液，缓冲溶液用H3PO4 调pH值至4.50，流动相比例为25∶75，等度洗脱；流速:1mL·min-1；进样量:10μL；样品为0.5mg·mL-1 生物素乙醇溶液；检测波长:215nm；定值波长215nm； 保留时间:5.02min； 色谱柱:Inertsil ODS3.250mm×4.6×5μm(GL Science Inc.日本)。
    ②其他杂质定值
    水分和挥发性物质采用热重分析法(TGA)进行测定，灰分测定依据GB/T9741-1988《化学试剂灼烧残渣测定通用方法》测定灼烧残渣，无机元素测定是基于DZ/T0223-2001电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)分析方法通则，采用Finnigan MAT的HR-ICP-MS进行分析测定，测定了73种无机离子。
    (2)差示扫描量热法(DSC)
    对于DSC的分析方法，采用逐级升温法测量纯度，选用了不同的升温速率0.5℃/min、0.8℃/min 和1.0℃/min测量纯度，优化了仪器参数。
    样品坩埚型号:铝皿(PE仪器自带)；样品量:约1.0mg。
    纯度测试条件:210℃恒温2min，以1℃/min升温至240℃；热阻:30.5℃/W；积分区间:5%～60%。
    

二、结果与讨论

    1.定性分析
    图1为生物素的红外光谱图，与日本AIST标准图谱一致，可以确定样品为生物素。
    2.定值分析
    (1)质量平衡法
    ①液相色谱法
    液相色谱法测定生物素的纯度结果如表1所示，色谱图如图2所示。
    ②其他杂质测定
    测定的灰分含量总和为0.023%；73种无机元素总含量为0.049%，使用热重分析法测定水分与挥发性成分，总量为0.086%。
    

<CTSM>    表1  生物素纯度定值结果</CTSM>
    

图1  生物素红外光谱图
    生物素质量平衡法的实验结果如表1所示。
    (2)差示扫描量热法
    DSC法是根据熔点下降测定物质纯度的方法，要求物质相变可逆稳定，且在过程中没有分解，从而保证相变的可逆性。采用DSC法测定生物素的实验结果如表1所示，图谱如图3所示。
    

图2  生物素液相色谱图
    

图3  生物素差示扫描量热图
    (3)定值结果
    定值结果首先需要对选用的两种定值方法进行一致性检验，一致性检验原则是对两种方法定值结果进行F检验和t检验。
    ①如果等精度:
    

    ②如果不等精度，但结果相近(F检验不通过，t检验通过):以加权平均值作为定值结果。
    

    式中:x1、x2——两种方法的测定结果；uM1、uM2——两种方法的不确定度；W1、W2——两种方法的权重；y——定值结果。
    由质量平衡法与差示扫描量热法数据，可进行F检验与t检验，代入公式计算，可得到F检验结果为:
    F=0.74，又f1α=6.03，f2α=0.166，满足f2α<F<f1α，故F检验通过。
    t检验结果为:
t|=2.12，又tα ，(n1 +n2-2 )=2.92，满足|t|<tα，(n1+n2-2)，故t检验通过。
    式中:n1、n2——两种方法的测定次数；α——置信度。
    因此，一致性检验通过，定值结果按照等精度要求进行计算，即
    按照公式:可计算得y=99.05%两种方法的定值结果为99.05%。
    (4)均匀性检验
    均匀性检验实验采用瓶间均匀性评估方案一进行标准物质的均匀性检验:从全部样品300瓶中随机抽取15个包装，每瓶取3个子样，每个子样测定3次，用液相色谱法进行测定。并采用单因素方差分析法判断样品的均匀性。
    ①组间方差之和:
    ②组内方差值和:
    

    可作统计量
    由此可以知道，该统计量是自由度为(ν1，ν2)的F分布变量。
    根据自由度(ν1，ν2)及给定的显著性水平α，可由F分布临界值表查得临界的Fα 值。若算得的F值有F<Fα，则认为数据组间无明显差异。
    式中:n、m、N———每个样品测量次数、组数和样品总测量个数；S1、S2 和ν1、ν2———组间和组内标准偏差及其自由度。
    均匀性检验结果如表2所示。
    

表2  生物素纯度标准物质均匀性检验结果
    由均匀性检验数据可按公式计算出瓶间方差和、瓶内方差和、F的值，通过可判定生物素标准物质是均匀的。
    (6)稳定性考察
    标准物质稳定性考察按先密后疏的原则，在一定时间间隔内，选择液相色谱法检测在规定条件下保存的标准物质纯度随时间的变化情况。采用同步稳定性研究考察生物素标准物质的短期稳定性和长期稳定性。
    短期稳定性:将生物素样品置于常温储存条件(最低要求的运输条件)，分别进行其7天、15天、30天的稳定性监测。每次取6个包装，每个包装取一个子样，重复测量3次，计算平均值，把5个包装测量结果平均值作为检测结果。
    长期稳定性:将生物素样品置于低温(4℃)储存条件，分别在第1、3、6个月进行稳定性监测。
    长期和短期稳定性检测计算结果如表3、表4所示。表3中数据表明生物素标准物质量值在分析值的不确定度内无显著的变化趋势，由于其动力学机制未知，因此选择经验线性模型对其稳定性进行评估。以X代表时间，以Y代表生物素的含量，进行线性拟合，生物素标准物质的稳定性考察结果的线性拟合和统计参数如表4所示。
    由表4可知，稳定性考查所得数据均能满足稳定性判定公式，表明生物素标准物质的稳定性是可靠的。
    

表3  生物素稳定性检验结果
    

表3  生物素稳定性考察结果的线性拟合合统计参数
    三、不确定度评定
    对于标准物质来说，其定值结果的不确定度由标准物质的定值过程带来的不确定度，标准物质的均匀性引起的不确定度以及标准物质的稳定性引起的不确定度3部分组成。评定结果如表5所示。
    1.标准物质不确定度评定结果标准物质的不确定度计算公式如下:
    

    可计算出生物素标准物质的不确定度为
    

    2.相对扩展不确定度
    相对扩展不确定度:U=uCRM×k=0.7%(k=2)研制的生物素纯度标准物质定值结果为99.1%，相对扩展不确定度为0.7%(k=2)。
    

表5  生物素标准物质的不确定度评定