液相色谱仪紫外检测器首次检定的探讨

液相色谱仪首次检定的时间比较长, 所以需要提前一天跟客户沟通, 询问检测器类型, 详细了解平常做样所使用的流动相。若流动相为正相, 则需要转换成反相系统 (根据JJG705-2014《液相色谱仪检定规程》使用水或甲醇作为流动相) 。由于正相系统的流动相为正己烷, 与水或者甲醇互不相溶, 需要异丙醇作为过渡流动相, 冲洗一段时间后转换成水或者甲醇。若流动相为缓冲盐溶液, 需要用水冲洗足够时间才能转换成甲醇, 否则盐溶液遇到甲醇后会立刻结晶堵塞管路。冲洗管路需要较长的时间, 若检定当天再冲洗会降低效率, 所以尽量征得客户同意, 提前将液相色谱仪的流动相状态调节为检定所需的状态。流动相也可要求客户提前一天配好, 根据规程需要提前准备100%甲醇、纯水、0.1%丙酮的水溶液、2%异丙醇水溶液, 超声脱气以备检定所需。

按照规程要求进行试验, 可以比较顺利地进行这一部分。这部分的误差来源除了仪器本身的误差, 测量产生的误差主要由流动相在不同温度下密度的不同和流动相的挥发性造成。此处, 需要查表或者通过计算将流动相温度对密度的影响考虑进去。同时甲醇的挥发性远大于水的挥发性, 而首次检定中的梯度误差项目需要以纯水为流动相进行检定, 笔者一开始就用纯水作为流动相平衡液相色谱仪, 所以此处检定选用纯水为流动相, 且在收集纯水时一定要用封口膜将容量瓶仔细封好, 收集完后及时称重。

图1 进20μL空气针后得到的梯度洗脱谱图

试验方法:准备两瓶流动相, A溶剂为纯水, B溶剂为0.1%丙酮的水溶液, 流速为 (2~3) m L/min, 波长为254nm, 用两通替代色谱柱并用A溶剂冲洗系统, 等基线平衡后按照规程要求的梯度洗脱程序执行。梯度结束后, 用A溶剂冲洗, 使系统平衡一段时间, 回复到初始状态后进行重复测量。检定梯度误差过程中需要注意不可空气针进样, 否则会造成图1与图2的差异。图1进样后出现鬼峰的直接原因是进样带入的少量气泡在检测器上引起噪声, 虽然从图中可以看出对检定影响的时间很短, 但需要尽量避免。笔者建议若是自动进样器将进样量设置为0μL, 若为手动进样直接将六通阀转子从取样位置转动到进样位置触发程序运行。另外, 由B溶剂变化所产生的每一段阶梯对应的响应信号值可通过放大谱图对应的阶梯, 直接从Y轴上读取信号值。

图2 自动进样体积设置为0μL得到的梯度洗脱谱图

紫外吸收检测器是液相色谱中应用最为广泛的检测器, 主要包括紫外-可见光检测器和二极管阵列检测器。根据规程采用紫外分光光度计溶液标准物质检定, 其中参考波长235nm和313nm为波谷, 257nm和350nm为波峰。由于紫外分光光度计溶液的成分是重铬酸钾的高氯酸水溶液, 如果用注射器将标准物质从检测器入口直接注入, 注射用量大容易造成检测器污染, 后期需要花费大量时间用纯水冲洗, 所以应尽量避免采用从检测器入口直接注入法。可采用将标准物质作为样品微量进样, 随着流动相进入检测器后读取信号值, 由于进样用量少可以避免对检测器的污染。具体操作方法如下:由于直接进重铬酸钾的高氯酸水溶液样品时对色谱柱的固定相有一定影响, 必须采用两通替代色谱柱, 用纯水做流动相, 流量设置为 (0.5~1) m L/min, 冲洗稳定后, 将标准物质当成样品进样 (10~20) μL, 对单波长、多波长不带扫描功能的检测器采用步进进样方法 (即每改变1nm波长记录每个样品峰高) , 对带扫描的检测器可调出光谱谱图直接读出波谷和波峰。

图3 线性范围谱图 (其中长竖线为进样分割线, 截图篇幅有限只截取一段作为示例) 

检测器具有较宽的线性范围, 在进行定量分析时可同时对主要组分和痕量组分进行测量, 这是考核检测器性能的重要指标。笔者按照规程采用直接注入的方式发现, 由于人为手动注入的速度不一致, 难以在检测器上读取一个稳定的示值。故变更方法为:配置一系列不同浓度丙酮-2%异丙醇水溶液 (丙酮含量为0.1%、0.2%、……、1.0%) , 检测器波长设定为254nm, 用两通替代色谱柱, 用2%异丙醇-水溶液做流动相, 流量设置为 (0.5~1) m L/min, 冲洗稳定后, 将不同浓度的丙酮-2%异丙醇水溶液作为样品依次进样相同体积后得到的响应值 (峰高或者峰面积) 记录下来 (图3为谱图部分截屏) , 详细数据如表1所示。

据笔者所见, 用该方法按照规程用5个丙酮溶液浓度 (0.1%、0.2%、……、0.5%) 与相对应的峰面积或者峰高做标准曲线, 会遇到求得大于0.5%浓度各点读数的曲线值与测量值的差值不超过5%的情况 (见表1用峰面积或者峰高表示的数据) 。若遇到没有超过5%的情况, 原则上还没有找到检测器的真正检测上限CH, 笔者建议此时可以在规程基础上适当增加测量点, 使丙酮溶液浓度增加为1.1%、1.2%、……直到找到差值超过5%所对应的那个浓度作为检测上限CH。

另外, 不同浓度丙酮-2%异丙醇水溶液极易挥发, 需要现配现用。为提高效率, 可以在做梯度误差的空当来配置该系列标准溶液。由于丙酮的易挥发, 容易影响标准曲线的线性, 可以先配置1.0%丙酮-2%异丙醇水溶液作为母液, 再分别稀释到响应的低浓度, 即分别取1m L、2m L、……、9m L母液用2%异丙醇水溶液定容到10m L容量瓶内, 可得到0.1%、0.2%、……、0.9%的丙酮-2%异丙醇水溶液。

本文该项目之前的流动相为纯水或者2%异丙醇水溶液, 所以需要更换流动相为100%甲醇, 两通连接冲洗一段时间后更换成C18柱, 用流量1.0m L/min冲至基线平衡后才能开始记录基线30min。按规程要求读取基线噪声和基线漂移。紫外检测器的最小检测浓度采用1.00×10-7g/m L萘-甲醇溶液进行检定, 由于含量很低, 谱图上通常相邻有其他峰同时检出, 难以辨别哪个是萘峰, 可以通过整机性能检定中萘的保留时间来进行定位。

因为检定基线噪声漂移、最小检测浓度时, 仪器已经冲洗平衡, 所以整机性能这个项目检定起来比较顺利。同时, 柱温箱的检定按照规程要求逐项检定便可, 不再复述。