CAR-T和疫苗流式细胞术质控样品的评价：现行行业标准

CAR-T疗法给生物分析科学家带来了前所未有的机遇和挑战。

我们正在目睹下一代CAR-T制剂和新的临床试验数量的爆炸性增长，这引起了人们对标准化化验和确保质量控制的日益浓厚的兴趣。流式细胞术分析是临床试验中用于监测细胞动力学(PK)和CAR-T疗法疗效的关键方法，在疫苗试验中也越来越受欢迎。流式细胞术可以记录疫苗诱导的免疫原性与自然免疫原性；疫苗接种量和应答率(效力)；支持最终疫苗配方的合理性；并证明与其他疫苗相比不存在劣势。高参数流式细胞术可以应用于临床试验T细胞探查终点，但需要严格的专用仪器优化、抗体(Ab)板设计、样品制备、检测设置和数据分析。

目前还没有关于一般流式细胞术分析验证或专门用于流式细胞术检测CAR-T水平的最终监管指南，这促使国际临床细胞学协会和CLSI的一个专家联盟制定了指南: CLSI. CLSI Guideline H62: Validation of Assays Performed by Flow Cytometry (2019). https://www.wrib.org/PDFs/Flow_H62_Proposed_Draft-190919.pdfGoogle Scholar

主要的监管关注点是证明CAR-T检测确实检测到了所需的分析物和QC样本，为了解决这个问题，2019年生物分析白皮书建议使用与目标细胞群体相关的QC样本，如稳定化处理的全血、冻存的PBMC或“人为添加目标细胞”的QC样本。建议QC的实施至少要定期跟踪检测、持续进行。

根据第一个获得批准的CAR-T疗法的实际经验，2020年的建议重点描述了与实施传统QC相关的实际限制，同时提出了确保流式细胞仪分析质量的方法，这些方法包括：仪器标准化、适当的方案设计以排除不需要的细胞、个性化的设门、活性染料，以及基于微球或体积的细胞计数方法。

目前使用两种类型的对照：试验特异性对照和系统水平对照。 试验特异性对照是包含不同比例CAR-T细胞的QC样本，包括转染的细胞系、转导的健康供体细胞或患者CAR-T产品，每一种都有其各自的优点和局限性。

•转染的细胞系是创建表达已知水平的CAR-T结构的同源对照的绝佳选择，但是转染的细胞并不表达那些患者样本设门所需的T细胞标记物。•虽然转导的健康供体T细胞散射光特性与化疗后的患者样本不同，但它们是建立初始设门和验证参数的最实用的选择。•患者CAR-T细胞产品是理想的对照，但它们在CAR-T监测分析中的可用性受到限制。因为这类样本通常只在产品发放前的质检分析和患者治疗中监控优先使用。

试验特异性对照的可靠性取决于3个关键因素：(1)仪器，(2)检测试剂的稳定性，(3)

应监测的试验特异性对照的稳定性。 

应该使用中心实验室进行标准化，使用相同的仪器类型和光学配置、相同的细胞系和相同批次的关键试剂来统一所有站点的结果。

系统水平对照通常用于临床诊断，因此对于监测CAR-T PK是可靠的(参见下表)，其QC实践包括以下要点；

•流式细胞仪：Setup微球的性能结果应可接受；标准化微球确认靶通道的平均荧光强度稳定一致；•抗体：在临床试验实施之前，“新的”个体抗体和“预混”抗体应该表现出与“正在使用的”抗体相似的特异性和MFI结果；抗体仅限在指定的有效期内使用。•只使用预检合格的关键缓冲液，如裂解液和染色缓冲液；使用“测试”样本前应进行活力检测或pH验证。

其它需要关注的要点有：

1.CAR-T流式细胞仪检测需要借鉴疫苗研发时仪器和检测设置方面的经验。建议在免疫学研究中使用最新的同行评审流式细胞术和细胞分选的指南来支持CAR-T分析的研发：

•Cossarizza A, Chang H-D, Radbruch A et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology 49(10), 1457–1973 (2019).

2.仪器设置应基于每个检测器的染色指数，以确定最佳灵敏度并将Spillover/Spread矩阵(SSM)降至最低。还需要使用3套微球(补偿微球、单峰微球和rainbow微球)对仪器精度和灵敏度进行日常性能检查：

•Perfetto SP, Ambrozak D, Nguyen R et al. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1(3), 1522–1530 (2006).•Perfetto SP, Ambrozak D, Nguyen R et al. Quality assurance for polychromatic flow cytometry using a suite of calibration beads. Nature Protocols 7, 2067–2079 (2012).

3.检查光电倍增管(PMT)响应的线性很重要。4.检测设置应包括方案优化、背景评估、门控策略、特异性、精密度、线性和LOB/LOD等指标。5.CAR-T检测通常与其他细胞表面标记一起以多色、多路复用的方式进行。6.应彻底明确来自其他染色试剂的潜在干扰。

随着现在CAR-T治疗的流行，流式的检测这块也得跟上，相信上面的这些信息，会给CAR-T治疗的监测工作标准化和统一带来不少帮助。