质控样品对食品中乳酸菌检验结果准确性的影响探讨

乳酸菌主要由乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属组成。根据国家标准，食品中乳酸菌总数计数值应等于嗜热链球菌、乳杆菌分别计数值之和。如何准确区分厌氧和需氧培养条件下的乳杆菌和嗜热链球菌，并分别进行计数是试验数据准确性的关键。本实验用乳酸菌检验质控样品以GB4789.35-2016 所规定的方法，对乳酸菌总数进行测定，结果发现：仅通过简单的菌落形态判断不足以区分目标菌，可造成试验结果的较大偏差。在分析原因并增加辅助鉴别方法后，重新用质控样进行试验，效果满意。

1　实验材料
培养基：MRS 琼脂、MC 琼脂。试验材料：乳酸菌检验质控样品。
满意值： 乳酸菌总数9.6×107~3×10⁸ CFU/瓶、乳杆菌数8.5×107~2.6×10⁸ CFU/ 瓶、嗜热链球菌数1.1×107~3.3×10⁷ CFU/ 瓶。
2　试验方法和结果分析
2.1　第一次试验
2.1.1　方法简述
选取质控菌悬液各1 mL 分别倾注MRS、改良MRS 和MC 琼脂制成平板，其中MRS 和改良MRS 平板置36 ℃厌氧培养48 h，MC 培养基置36 ℃培养48 h，分别计数MRS 平板上的乳杆菌菌落数（所有菌落）和MC 平板上嗜热链球菌菌落数（直径2 mm 粉红色圆形菌落），两者之和为乳酸菌总数。
2.1.2　试验结果
MRS 平板上乳杆菌总数1.71×10⁸CFU/ 瓶，MC 平板上嗜热链球菌总数1.53×10⁸ CFU/ 瓶，乳酸菌总数：3.3×10⁸ 个/ 瓶，与质控样标准比较，嗜热链球菌和乳酸菌总数均不符合质控样要求。
2.1.3　结果异常分析
（1）MC 培养基，平板菌落形态：有两种外观相似——菌落均为圆形，呈淡粉色或白色，有红色中心，有淡淡的粉色沉淀环，但菌落直径大小不一，大的2~3 mm，小的1~2 mm。将两种菌落纯化分离后鉴定，结果如下。革兰氏染色：大菌落为革兰氏阳性长弯曲杆状菌，无芽孢；小菌落为革兰氏阳性球杆状，呈链状分布。
（2）MRS 培养基， 平板菌落形态：有两种菌落形态，一种为直径约3mm，黄色，凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落正面呈圆形、侧面呈三棱梭型；另一种为直径约1mm，黄色，边缘光滑，呈圆形。将两种菌落纯化分离后鉴定，结果如下。革兰氏染色：大菌落为革兰氏阳性短杆菌，无芽孢，呈链状分布；小菌落为革兰氏阳性球杆状，呈链状分布。生化鉴定结果：七叶苷、水杨苷、甘露醇、山梨醇，大菌落均为阳性，小菌落均为阴性。

综合上述结果分析： 在MRS 和MC 培养基上生长的大菌落初步判断为乳杆菌菌落，小菌落为嗜热链球菌
菌落。因嗜热链球菌和部分乳杆菌均有兼性厌氧生长特性，在厌氧条件下MRS 培养基上有嗜热链球菌的生长，而好氧条件下MC 培养基上也存在乳杆菌的生长[2]。因此，在不同培养条件的培养基上，应当先排除非目标菌落后再进行计数。
2.2　第二次试验
2.2.1　方法改进
首先， 区分不同大小和形态菌落，MRS 培养基上若出现两种或以上的不同菌落时，选择菌落较大直径约
3mm，饱满，边缘光滑整齐的白色或黄色菌落进行计数，并将其余直径较小（＜ 2mm）菌落进行纯培养，辅以染色镜检和生化试验进行鉴定排除。

同理，如果在MC 培养基上出现两种或以上不同菌落时，选取直径较小，圆形规则，粉色或红色菌落进行计数，将直径超过2 mm 但其他形态相似的菌落纯培养后，辅以染色镜检和生化试验进行鉴定排除。
2.2.2　试验结果
MRS 平板上乳杆菌总数1.4×10⁸CFU/ 瓶，MC 平板上嗜热链球菌总2.6×10⁷CFU/ 瓶， 乳酸菌总数1.7×10⁸个/ 瓶，与质控样标准比较，结果符合要求。
3　讨论
通过两次试验数据比较，第二次结果刚好为第一次的1/2，而第一次的乳酸菌总数约等于第二次乳酸菌总数，MRS 培养基上的菌落总数即为真实的乳酸菌总数。就本次实验而言，质控样在MRS培养基上的两种不同菌落总数即为最终的乳酸菌总数，证明兼性厌氧的乳杆菌和嗜热链球菌的重复计数是造成数据偏差的主要原因。因此，为避免重复计数，在实际产品检验中，要考虑到样品基质和菌种种类的不同，充分利用分离和鉴定手段，识别并剔除非目标菌后才能进行计数操作。只有以使用乳酸菌检验质控样为前提对实验操作进行验证后，方可有把握地开展正式检验。

参考文献
[1] 张全温, 冯云. 乳酸菌检验方法的探究[J]. 中国现代药物应用,2012(16).
[2] 俞漪, 胡雪莲. 酸乳中乳酸菌计数方法的改进[J]. 农产品加工学刊,2014(2).
[3] 胡巅, 张广伟, 丁武. 关于食品中乳酸菌检验标准方法若干问题的探讨[J]. 中国卫生检验杂志,2010(10).