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核酸检测试剂盒中标准物质溯源性现状

一、计量学溯源性的重要性

目前核酸检测试剂盒已应用于血液筛查、病毒检测、肿瘤基因突变检测、遗传病检测、呼吸道疾病病原体检测、转基因检测、食品安全检测、环境微生物检测、重大动物疫病检测等诸多领域,检测结果的准确、可比是保证检测质量的前提。

目前核酸定量检测试剂盒大多采用实时荧光定量PCR技术,以已知量值的工作标准物质作为外标,通过绘制标准曲线得到未知样品的量值。因此,核酸检测试剂盒中工作标准物质的量值准确性是核酸定量检测的核心,而工作标准物质的计量学溯源性是保证核酸检测试剂盒检测结果准确、可比的关键。

二、核酸检测试剂盒中标准物质溯源性现状

1. 溯源性技术标准

针对核酸检测试剂盒中工作标准物质的溯源性,属于体外诊断试剂的核酸检测试剂盒可参照GB/T21415-2008《体外诊断医疗器械生物样品中量的测量校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》。此标准等同采用ISO17511:2003,其对体外诊断医疗器械产品中校准品的溯源性作出了规定。

根据GB/T21415-2008的规定,样品测量结果的溯源性通过一系列不同等级的参考测量程序和校准物组成的溯源链来保证。一级参考测量程序是具有最高计量学特性的参考测量程序,可用SI单位表示完整的不确定度,不必使用被测量的测量标准为参考,结果即可接受。一级校准品是具有最小测量不确定度的测量单位的实物体现,它可由一级参考测量过程直接定值,也可通过可靠的杂质分析间接定值。

在中国合格评定国家认可委员会(CNAS)认证认可领域,CNAS-CL06:2014《测量结果的溯源性要求》对合格评定机构的测量结果作出了溯源性要求;农业部对于转基因产品检测的标准物质作出了相应的技术规范要求。但是,目前我国尚无针对核酸检测试剂盒溯源性提出统一明确要求的技术标准。

2. 核酸定量方法

由于核酸等生物大分子的复杂性,各国国家计量院及其他科研人员致力于研究电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)及液相色谱同位素稀释质谱(LC-IDMS)等不确定度水平低、可溯源至SI单位的方法。目前,国际上逐渐推广应用的数字PCR方法采用不依赖于外标的绝对定值方法有可能成为核酸检测中的高等级测量方法。核酸检测试剂盒生产商及核酸检测实验室通常采用紫外分光光度法,利用核酸在260nm的紫外吸收对工作标准物质进行定值。但是这种方法的灵敏度较低,且易受到其他物质的干扰而影响准确度。因此向通过高等级测量方法或国际赋值方案得到的有证标准物质进行溯源,是保证工作标准物质量值准确可比的重要途径。

3. 国际组织溯源性要求

世界卫生组织(WHO)通过多中心研究,建立了HAV RNA、HBV DNA、HCV RNA、HDV RNA、HEV RNA、HPV DNA、HIV-1 RNA、EBV DNA、B19V DNA和HCMV DNA等核酸检测用国际标准品,研制单位为英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)。其提供的病毒核酸标准物质为含有灭活的野生型病毒的人混合阳性血浆稀释后的冻干样品,量值的确定由各国多中心合作研究定值,表述单位为IU,使当前不同实验室、不同检测方法得出的检测结果的表述单位(如genome equivalents/ml,copies/m L,PCR detectable units/m L等)得到统一并具有可比性。

美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)目前可提供人巨细胞病毒DNA(HCMV DNA)等标准物质。

4. 国内有证标准物质

国内核酸检测用有证标准物质有卫生部临床检验中心、上海市临检中心、广州邦德盛生物科技有限公司、北京康彻思坦生物技术有限公司等单位研制的HBV、HCV、HPV、HIV、EBV、HCMV等国家标准物质。其量值可溯源至WHO国际标准品。

中国计量科学研究院在转基因检测、人基因突变等标准物质方面致力于研制具备溯源性的国家标准物

质(GBW10070~GBW10077,GBW10090~GBW10097,GBW(E)090641~GBW(E)090652等),其量值可溯源至SI单位,具备高等级计量学品质。

另外,中国食品药品检定研究院针对核酸检测试剂盒研制了大量国家参考品,这类国家参考品通常为包含阳性参考品、阴性参考品、定量参考品、线性参考品、灵敏度参考品等产品注册用成套的参考品。

5. 溯源性建立

以国际或国内有证标准物质作为高等级计量标准,可实现核酸检测试剂盒中工作标准物质的溯源。因此制定统一的技术标准,使其按照统一的要求选择溯源标准,建立溯源途径,可保证检测结果的可比性和核酸检测行业的规范性。

三、讨论

在调研过程中发现市场上定量核酸检测产品相对较少,食品微生物检测、转基因检测、重大疫情检测等产品多为定性检测,而且所用工作标准物质缺乏对“溯源性”的认识或对产品的溯源性要求。造成这种状况的原因一方面由于定量检测需要有量值准确的外标,而国内除了临床诊断相关的试剂具有有证标准物质或国家参考品外,其他对象的标准物质国内相对缺乏,国外的标准物质又不易获得或是定价较高;另一方面国家对于此类产品的市场流通没有注册要求,造成市场对“溯源性”的认识相对缺乏,现状较为混乱;再者如食品微生物检测领域对于量值的准确性要求并不像体外诊断般严格,或者可能目前的检测手段分辨力不够高造成无法准确定量。

四、结束语

根据核酸检测试剂盒中工作标准物质的溯源性现状,只有使其在计量学上溯源至高等级的计量标准才能真正实现单位统一、量值准确,实现检测结果的可比和互认。这一方面需要国家制定相关的技术标准,对核酸检测试剂盒的工作标准物质提出统一的溯源性要求,另一方面需要国家相关机构加快研制高等级的计量标准,使得核酸检测试剂盒中工作标准物质溯源性的实现有据可依,有源可溯。
作者:牛春艳 高运华 王晶 傅博强 董莲华
中国计量科学研究院

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